正常なゲノム機能には、トポロジー的に関連するドメイン境界が必要です

Communications Biology volume 6、記事番号: 435 (2023) この記事を引用

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トポロジー関連ドメイン (TAD) 境界は、ゲノムを個別の制御領域に分割します。逸話的証拠は、それらの破壊が正常な遺伝子発現を妨げ、疾患の表現型を引き起こす可能性があることを示唆しています 1、2、3 が、これがどの程度起こるのか全体的な程度は不明のままです。今回我々は、TAD境界の標的欠失が正常な生体内ゲノム機能と生物発生にさまざまな混乱を引き起こすことを実証する。私たちはマウスで CRISPR ゲノム編集を使用し、ゲノムから 8 つの TAD 境界 (サイズ 11 ～ 80 kb) を個別に削除しました。検査されたすべての欠失は、クロマチン相互作用または遺伝子発現の変化、生存率の低下、および解剖学的表現型を含む、検出可能な分子または生物表現型をもたらしました。 8 件中 7 件 (88%) のケースで、TAD の融合や削除された境界に隣接する TAD 内の接触頻度の変化など、局所 3D クロマチン構造の変化が観察されました。調べた8遺伝子座のうち5遺伝子座(63%)では、境界欠失が胎児致死率または他の発生表現型の増加と関連していた。例えば、Smad3/Smad6付近のTAD境界欠失は完全な胎児致死を引き起こし、一方、Tbx5/Lhx5付近の欠失は重度の肺奇形を引き起こした。我々の発見は、生体内ゲノム機能におけるTAD境界配列の重要性を実証し、臨床遺伝学スクリーニングにおいてTAD境界に影響を与える非コード欠失の潜在的な病原性を慎重に検討する重要な必要性を強化するものである。

真核生物のゲノムは、ドメイン内のクロマチン接触頻度が高いことを特徴とするサブメガベーススケールのクロマチンセグメントであるトポロジー関連ドメイン (TAD) に折りたたまれます 4,5,6。 TAD は、制御配列が相互作用できるクロマチン近傍を定義すると同時に、境界を越えて制御相互作用を遮断することにより、階層的ゲノム構成の重要な特徴を表します 5、7、8、9、10。 TAD 境界は主にクロマチン立体構造アッセイによって定義および測定され、通常は CCCTC 結合因子 (CTCF)、コヒーシンやコンデンシンなどの染色体構造維持 (SMC) 複合体の構成要素、およびRNAポリメラーゼII5、11、12、13、14。 TAD はループ押出の結果として形成され、収束配向で結合した CTCF 分子が出会うまで、DNA 鎖がコヒーシンまたは SMC 複合体内から滑り出します 13、15、16、17、18、19。 CTCF、コヒーシン、またはコヒーシン負荷因子 Nipbl の喪失は TAD 破壊をもたらしますが、コヒーシン放出因子 Wapl の喪失は TAD 境界の強化をもたらします 20,21。興味深いことに、CTCF22 の喪失後も、TAD 境界の約 20% は安定したままです。 CTCF媒介メカニズムと転写はどちらもTADの形成と機能に影響を与える可能性がありますが、どちらも個別に十分ではなく、普遍的に必要であるとも思われません7、11、23、24。したがって、クロマチン状態、転写活性、および TAD 構成は相互に影響を及ぼしている可能性があり、観察される哺乳類ゲノムの核構造はそれらの複雑な相互作用から生じる可能性があります 7、11、23、24、25。

TAD 境界のゲノム位置は哺乳類種全体でよく保存されており、ゲノム内での TAD 境界の機能と位置が進化的な制約を受けていることが示されています 5、26、27、28。この概念は、一般のヒト集団で観察される TAD 境界における構造変異体の全体的な枯渇によってさらに裏付けられています 26。一方、TAD 構造の破壊と再構成は遺伝子の誤発現に関与しており、発生およびがんの表現型に関連しています 1、2、 3、29、30。しかし、これらの破壊のほとんどは、制御要素および/またはタンパク質コード遺伝子などの隣接するゲノム特徴も含む、自然発生的に発生した大きな構造変異でした。したがって、これらの表現型における TAD 境界の具体的な役割はよく理解されていません。本研究では、生体内での TAD 境界配列の機能的必要性を検討します。私たちは、胚発生中に活性な遺伝子の近傍にある8つの独立したTAD境界を選択し、これらの境界をマウスゲノムから個別に削除し、生存、ゲノム構成、遺伝子発現、および発生への影響を体系的に調べました。 8 つの TAD 境界の欠失はすべて、これらの特性の 1 つ以上の変化を引き起こしました。また、より多くのCTCF部位による境界の喪失は一般により重篤な表現型をもたらし、最も重篤な生物表現型はクロマチン構造の顕著な変化と一致することも観察した。総合すると、我々の結果は、TAD 境界配列が正常なゲノム機能と発生に必要であることを示しています。

3300 previously annotated TAD boundaries5,10, we scored and prioritized each boundary based on the following criteria: (1) CTCF occupancy aggregated from 62 published CTCF ChIP-seq datasets, which served as a proxy for the expected overall strength of insulation (datasets listed in Supplementary Data 1); (2) co-occupancy of subunits of the cohesin complex and the transcription factor Znf14331 from 38 published ChIP-seq datasets (Supplementary Data 1); (3) CTCF-binding conservation at orthologous regions in four different mammalian species32 (Supplementary Data 2); and (4) whether both flanking TADs contain genes with known roles in embryonic development, preferentially showing divergent patterns of tissue-specific expression (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 1–3, “Methods”). TAD boundaries that encompassed protein-coding genes were excluded. Following genome-wide prioritization, we selected and deleted 8 individual TAD boundaries from the mouse genome through pronuclear injection of fertilized eggs using CRISPR/Cas9. For all deletions, the outer borders of the boundaries were defined by canonical criteria including the presence of CTCFs and cohesin complex proteins, which are the hallmark of TAD boundaries that are conserved across cell types in closely related species (refs. 13,15,16,17,18,19; see “Methods” for details). These deletions ranged in size from 11 to 80 kb and removed all known CTCF and cohesin binding sites in each TAD boundary region, while leaving any nearby protein-coding genes intact (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 3, “Methods”). For all eight boundaries, live founder mice heterozygous for the targeted deletion were successfully obtained and bred into stable lines to assess molecular and organismal phenotypes./p>

6000 data points across 350 total measurements; Fig. 4a, Supplementary Fig. 10 and Supplementary Data 7). These systematic phenotyping efforts identified 30 additional parameters with individually significant deviations from wild-type controls (Supplementary Data 7). However, due to the limited sample size and the large number of parameters assessed, these initial observations are generally not significant after correction for multiple hypothesis testing. Nevertheless, in conjunction with the independently observed viability, chromatin, and expression phenotypes in these lines, these data provide leads for further in-depth characterization./p>

0.05; Fig. 3 and Supplementary Fig. 4. Interaction frequencies between genomic loci were additionally visualized on Juicebox (Supplementary Fig. 4)53,54./p>