Nature volume 615、pages 925–933 (2023)この記事を引用
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275 オルトメトリック
メトリクスの詳細
全ゲノム倍加 (WGD) はヒトの癌で再発する現象であり、染色体の不安定性と異数性の獲得を促進します 1、2、3、4、5、6、7、8。 しかし、WGD 細胞におけるクロマチンの三次元構成と発癌表現型へのその寄与は現在不明です。 今回我々は、p53欠損細胞においてWGDがクロマチン分離（LCS）の喪失を誘導することを示す。 この現象は、短い染色体と長い染色体、A サブコンパートメントと B サブコンパートメント、および隣接するクロマチン ドメイン間の分離の減少によって特徴付けられます。 LCS は、四倍体チェックポイントの活性化を回避した細胞における CTCF および H3K9me3 の下方制御によって引き起こされます。 縦断的解析により、LCS が WGD 細胞におけるサブコンパートメントの再配置のためにゲノム領域を刺激することが明らかになりました。 これにより、WGD 細胞から生じる腫瘍における癌遺伝子の活性化に関連したクロマチンおよびエピジェネティックな変化が生じます。 注目すべきことに、サブコンパートメントの再配置イベントは染色体の変化とはほとんど独立しており、これはこれらが腫瘍の発生と進行に寄与する相補的なメカニズムであることを示しています。 全体的に見て、LCS はクロマチンの立体構造変化を引き起こし、最終的に発がん性のエピジェネティック修飾と転写修飾をもたらします。このことは、クロマチン進化が WGD によって引き起こされるがんの特徴であることを示唆しています。
WGD は、細胞内の染色体のセット全体の重複によって定義されます。 これはさまざまな組織の初期および前癌病変で観察されており 2、9、10、ヒトの癌の約 30% で発生すると推定されています 3。 WGD は、p53 欠損細胞や Rb 欠損細胞 3,4 などの許容的な遺伝的背景における染色体変化 5,6,7,8 の獲得を促進し、腫瘍形成を促進する可能性があります 1,5。 しかし、単一核における四倍体化は、クロマチンの三次元 (3D) 構造とエピジェネティックな特徴の変化を引き起こす可能性が同様にあります。 間期中、クロマチンはコンパートメント、クロマチンドメイン、およびループの多層 3D 構造で組織され 11、12、13、14、15、16 、クロマチン活性および細胞状態と密接に関連しています 17。 クロマチン構造の変化は多くの腫瘍タイプで報告されており、CTCF またはコヒーシン結合の変化 18,19、染色体構造変異 20,21,22、または異常なヒストン修飾 22,23,24,25 が原因です。 今回我々は、WGDを受ける細胞内でクロマチンがどのように組織化されるかを調査します。 さらに、クロマチン構造のどの特徴がWGDによって影響を受けるか、WGD後にクロマチン構成の変化が現れて細胞の表現型に影響を与えるかどうかを研究します。 最後に、これらの変化がWGD駆動腫瘍における遺伝的およびエピジェネティックな変化と相関するかどうかを調べます。
クロマチン組織化および腫瘍発生に対する WGD の影響を理解するために、我々は 3 つの異なる細胞モデルを使用しました。(1) 非形質転換二倍体細胞株 hTERT-RPE1 (以下、RPE と呼びます)。 (2) バレット食道患者由来の CP-A 細胞。WGD を介して食道腺癌を発症しやすい前癌状態であるバレット食道患者に由来する 9,26。 (3) 白血病性近三倍体 K562 細胞株。 ヒト腫瘍で観察される寛容な遺伝的背景を模倣するために 3,26、p53 欠損 CP-A (拡張データ図 1a) および RPE 細胞 (以前は RPETP53-/- 細胞と呼ばれていた) 27 を使用しました。 K562 細胞は、すでに TP53 遺伝子に機能喪失型変異を抱えています 28。 WGD 細胞は、2 つの独立した CP-A TP53-/- クローン（クローン 3 およびクローン 19）および K562 細胞における有糸分裂の滑りを通じて、また RPE TP53-/- 細胞における 2 つの異なるプロトコルを使用した細胞質分裂不全を通じて得られました（図 1a）。 WGDではなく染色体不安定性（CIN）に関連するクロマチン構造変化を制御するために、MPS1阻害剤を使用してRPE TP53-/-細胞にCINを誘導しました（図1a）。 細胞周期と核型の分析により、ほとんどの細胞で処理後に染色体の数が2倍になり（図1b、cおよび拡張データ図1b〜g）、核サイズが増加したことが確認されました（拡張データ図1h）。
1, adjusted P < 0.01) were enriched in the interferon signalling pathway (Extended Data Fig. 4b), which is consistent with responses to abnormal mitotic segregation and stress31. Conversely, significantly downregulated genes (n = 619, log2(FC) < −1, adjusted P < 0.01) were enriched in the DNA replication, DNA repair and cell cycle pathways (Extended Data Fig. 4c), which is consistent with downregulation of DNA replication proteins in WGD cells7. Changes in expression were not associated with changes in compartment segregation and only moderately with boundary loss of insulation (Extended Data Fig. 4d,e), which indicated that these changes mostly reflected an acute cell response to WGD. In summary, WGD cells, but not CIN-only cells, exhibit LCS manifested in an increased proportion of contacts between long and short chromosomes, distinct chromatin subcompartments, and TADs./p> 0.4), which is a known oncogenic variant37. Nevertheless, this mutation was already present in RPE TP53−/− cells before WGD, and it was not sufficient to induce tumorigenesis in mice (Fig. 4c). Conversely, mutations that were acquired post-WGD did not include known oncogenic variants (Supplementary Table 3)./p> 0.3). These changes comprised upregulation of inducers of cell proliferation and migration such as CDC42, NRAS and JUN (chromosome 1p)42,43, and downregulation of CENPF (chromosome 1q), which is associated with mitotic errors44. NRAS copy number gain was accompanied by an increase in Q61R variant allele frequency (VAFtumour1 = 0.9, VAFtumour2 = 0.75, VAFtumour3 = 0.74), which suggested that the mutated allele was in the amplified haplotype. JUN overexpression was concomitant with an upregulation of components of the AP-1 transcription factor complex (JUND, JUNB, FOS and FOSB) and its downstream targets (Extended Data Fig. 8h). In summary, tumours originated from RPE TP53−/− cells that underwent WGD exhibited hallmarks of WGD-driven human tumours, such as increased CIN and complex rearrangements potentially associated with oncogene activation./p>4N peak) were bulk sorted. Cells were allowed to recover overnight and then fixed for downstream analyses./p>90%). Only Hi-C interactions for which anchors mapped strictly to one of the two haplotypes were retained for analysis, thus obtaining three sets of interaction types: Hap1–Hap1, Hap1–Hap2 and Hap2–Hap2./p>2 for diploid loci) would indicate a nuclei aggregate rather than a single nucleus. Following dispensing, the single nuclei were de-crosslinked by incubation at 65 °C overnight. Next each selected nucleus was mixed with 25 µl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 and transferred to a 1.5 ml tube and incubated at room temperature for 1 h on a rotating wheel. The bead-bound fragments were digested with 10 U of AluI restriction enzyme (New England Biolabs, R0137) in 1× rCutSmart buffer (New England Biolabs, B6004) at 37 °C for 2 h. A-tailing reaction and adapter ligation were performed for each single cell as for the bulk Hi-C processing. Similarly, PCR amplification of the single cell libraries was performed in the same master mix as described above for bulk Hi-C, for 27–30 cycles. Libraries were cleaned using AMPure XP beads and then ran on a 2% agarose gel at 100 V for 50–60 min. Successful libraries presented a 300–700 bp smear, which was cut from the gel. DNA purification from the agarose was performed using NucleoSpin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel, 740609) following the manufacturer’s instructions. An additional AMPure XP bead size selection was generally necessary to remove any primer dimer contamination. Libraries were sequenced on a NextSeq550 platform (Illumina) in a PE75 configuration./p>= 6, it was kept./p>
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